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摘要：目的探討大豆肽（soybean peptide, SP)通過下調(diào)Notch 1信號通路防治哮喘大鼠氣道炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。方 法將60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對照組、哮喘模型組、地塞米松（DexamethaSone,Dex)0.5mg/kg組及大豆肽 600、300 及 150 mg/kg 劑量組。采用卵清蛋白（Ovalbumin, OVA) + 氨氣化f呂（Aluminum hydroxide, Al (OH) 3)法復(fù)制大 鼠哮喘動物模型，同時給予相應(yīng)劑量的大豆肽進(jìn)行干預(yù)，每天給藥1次，連續(xù)7 d。末次給藥24 h后收集大鼠肺泡灌洗 ye（broncho - alveolar lavge fluid, BALF),進(jìn)行白細(xì)胞分類計數(shù)；取大鼠右下葉肺組織常規(guī)HE染色，觀察肺組織病理學(xué) 改變及氣道重塑變化；采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western - blot法檢測大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF - kB mRNA 和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與哮喘模型組比較，大豆肽600 mg/kg劑量組大鼠BALF中的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸 性粒細(xì)胞計數(shù)顯著降低（P <0.01);大鼠肺組織病理損傷較模型組明顯改善，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少；大鼠肺組織 Notch 1、agged 1、Hes 1及NF - kB mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P <0. 05,P <0. 01)。結(jié)論大豆肽對哮喘大鼠 炎癥反應(yīng)具有防治作用，其機(jī)制與下調(diào)Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF-kB信號通路有關(guān)。
關(guān)鍵詞：大豆肽；哮喘;Notch 1;炎癥
支氣管哮喘（bronchial asthma, BA)簡稱“哮喘” 是一種常見的呼吸系統(tǒng)炎癥性病癥，往往伴有巨噬細(xì)
作者簡介:張玲（1981 -),女，本科，講師，研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病防治 通訊作者：徐松濤，E - mail:375874072@ qq. com 胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞 等炎性細(xì)胞浸潤和氣道上皮細(xì)胞損傷，出現(xiàn)氣道平滑 肌痙攣，表現(xiàn)為喘息、呼吸困難、氣急、劇烈咳嗽等哮 喘癥狀1。Notch 1信號通路是調(diào)控細(xì)胞分化、遷移、 凋亡、增殖、炎癥及腫瘤發(fā)生等生理病理過程的重要 信號分子12。研究報道，Notch 1信號通路激活后可 誘導(dǎo)氣道成纖維細(xì)胞分化和增殖，促使氣管重塑，引
發(fā)免疫系統(tǒng)紊亂,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)和促進(jìn)支 氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展。大豆肽（soybean peptide, SP)是大豆經(jīng)過酶解或微生物發(fā)酵分離提取得到的多 肽混合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、緩解疲勞等作 用。本研究觀察了大豆肽對哮喘大鼠的防治作 用，并以Notch 1信號通路為研究對象探討其抗炎平 喘分子機(jī)制。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動物SD大鼠（SPF級），雄性,w齡，體 重180 ~200 g,湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司， 許可證號：SCXK (湘）2011 -0003。將大鼠適應(yīng)性飼 養(yǎng)5d,每籠4 ~5只,3 ~4d更換1次墊料,調(diào)整室 內(nèi)溫度為 22 ±2°C,濕度為 45% ~ 65%, 12 h/12 h 光照周期，常規(guī)飲食水。
1.2主要試劑大豆肽，河南省南街村（集團(tuán)）有限 公司；地塞米松碟酸鈉注射液（Dexamethasone, Dex ) 國藥準(zhǔn)字H41020055,鄭州卓峰制藥有限公司；卵清 蛋白（Ovalbumin, OVA),美國 Sigma 公司；兔抗 Notch 1、Jagged 1、Hes 1、NF - kB 及卩-actin 抗體，羊抗兔 辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記二 抗、增強(qiáng)型RIPA蛋白裂解液、彩色預(yù)染蛋白Marker (10 ~180 KDa)、PVDF 膜及 SDS - PAGE 凝膠制備試 劑盒等均購自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol 總 RNA 抽提試劑、Easy - Load™ PCR Master Mix (Blue, x)、BeyoRT™ II cDNA第yi鏈合成試劑盒等 由上海碧云天生物技術(shù)有限公司南通分公司提供； PCR實(shí)驗(yàn)所需引物由南京金斯瑞生物科技有限公司 設(shè)計合成。
1.3實(shí)驗(yàn)動物分組及處理將SD雄性大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為：正常對照組、哮喘模型 組、地塞米松及大豆肽高、中、低劑量組。正常對照組 于實(shí)驗(yàn)第1 d和第7 d腹腔注射生理鹽水0. 2 ml,其它 各組于實(shí)驗(yàn)第1 d和第7 d腹腔注射致敏ye（OVA 5 mg +氯氧化鋁200 mg +生理鹽水1 ml充分混懸）0. 2 ml。第8 d,將大鼠置于誘咳引喘儀（XR - YLS -8A 多功能誘咳引喘儀，上海欣軟信息科技有限公司）中， 正常對照組大鼠用生理鹽水進(jìn)行霧化激發(fā)，其它組用 1% OVA生理鹽水溶液進(jìn)行霧化，1次/d,每次30 min。從霧化第2 d開始,于每次激發(fā)前正常對照組和 哮喘模型組灌胃生理鹽水，地塞米松組大鼠腹腔注射 地塞米松0. 5 mg/kg,大豆肽組大鼠分別灌胃大豆肽 600、00及150 mg/kg,連續(xù)激發(fā)和給藥7 d。末次激 發(fā)24 h后，將大鼠麻醉，快速取下肺組織，收集肺泡灌 洗液,進(jìn)行白細(xì)胞分類計數(shù)，然后將肺組織用生理鹽 水沖洗干凈，取右下葉肺組織用于組織學(xué)檢測，剩余 組織凍存于-80C超低溫冰箱中備用。
1.4大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察取大鼠右下葉肺組 織，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h,經(jīng)系列濃度乙 醇脫水后進(jìn)行石蠟包埋、切片及HE染色，顯微鏡下 觀察肺組織病理學(xué)改變。
1.5 RT - PCR法檢測大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表達(dá)水平取大鼠左上葉肺 組織約50 ~60 mg,置入盛有液氮的研缽中充分研磨 至粉末狀，加入1. 5 ml Trizol充分混勻裂解消化，12 000 rpm 4C離心20 min,吸取上清，根據(jù)試劑盒說明 書操作步驟進(jìn)行RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將逆轉(zhuǎn)錄 得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，各待測基因引物序 列見表1。
1.6 Western blot 法檢測大鼠肺組織 Notch 1、Jagged 1、Hes1及NF - kB蛋白表達(dá)水平取大鼠左下葉肺 組織約80?100 mg,剪碎置于離心管中，加1.5 ml RIPA裂解液于冰上充分勻漿,然后再裂解約30min, 4C 12 000rpm離心15min,取上清移入1.5mlEP管 中，進(jìn)行蛋白定量，并調(diào)整濃度一致。將上清樣品與 蛋白上樣緩沖液等體積混勻后煮沸5min,以25 ^l/
孔上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，依 次進(jìn)行封閉、一抗、二抗孵育、顯色及拍照等步驟，以 p - actin 為內(nèi)參,分析待測蛋白相對表達(dá)值。
1.7統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù) 處理,數(shù)據(jù)以Mean 盨D表示，多組間的兩兩比較采 用單因素方差分析（ one - way ANOVA)和 LSD - t 檢 驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a =0.05。
2 # 中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯增多
(P<0.001);與哮喘模型組比較，大豆肽600、300 2.1大豆肽對哮喘大鼠BALF中白細(xì)胞分類計數(shù)的 mg/kg組大鼠BALF中中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸 影響與正常對照組比較，哮喘模型組大鼠BALF中 性粒細(xì)胞數(shù)顯著降低（P <0.001)。結(jié)果見表2。
組別 | 濃度（mg/kg) | 中性粒細(xì)胞（107/L) | 淋巴細(xì)胞（107/L) | 嗜酸性粒細(xì)胞（107/L) |
正常對照 | - | 8.04±1.36 | 19.53?.64 | 3.53?.45 |
哮喘模型 | - | 20.96 ?.53b | 45.24 ?.47b | 12.09?.69b |
地塞米松 | 0. 5 | 9.71?.17d | 23.72?.55d | 4.43?.16ad |
大豆肽高劑量 | 600 | 11.61?.07c | 30.88 ?.89ac | 5.61?.40bd |
大豆肽中劑量 | 300 | 14.11?.47ac | 35.98 ?.08bc | 7.49?.63bc |
大豆肽低劑量 | 150 | 18.46?.59b | 43.62?.41b | 10.49?.80b |
F值 |
| 23.267 | 23.032 | 49.249 |
P值 |
| <0.001 | <0.001 | <0.001 |
表2大豆肽對哮喘大鼠BALF中白細(xì)胞分類計數(shù)的影響（x 眘，= 10)
注：與正常對照組比較,P <0.05, bP <0.01;與哮喘模型組比較,P <0.05, dP <0.01
2.2大豆肽對哮喘大鼠肺組織病理學(xué)變化的影響 增厚，管腔變窄，部分有膠原沉積；大豆肽600、00
正常對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡無萎縮塌陷， mg/kg組大鼠肺組織病理損傷較模型組明顯改善，炎
氣道內(nèi)壁未見增厚，偶見炎性細(xì)胞浸潤；哮喘模型組 性細(xì)胞浸潤減少，肺泡結(jié)構(gòu)較為完整，但仍不能恢復(fù)
&:正常對照組沁：哮喘模型組;〇:地塞米松組;3:大豆肽600瓜呂八呂;6:大豆肽300瓜呂八呂;£:大豆肽150瓜呂八呂大鼠肺組織可見多量、散在的炎性細(xì)胞浸潤，氣道壁 至正常。
圖1大豆肽對哮喘大鼠肺組織病理形態(tài)的影響（X200)
2.3大豆肽對哮喘大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表達(dá)水平的影響與正常對 照組比較，哮喘模型組大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（P < 0.001);與哮喘模型組比較，大豆肽600 mg/kg組大
鼠肺組織 Notch 1、agged 1、Hes 1 及 NF - kB mRNA 表達(dá)水平顯者下調(diào)（P <0. 001)。結(jié)果見圖2、表3。 2.4大豆肽對哮喘大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB蛋白表達(dá)水平的影響與正常對照 組比較，哮喘模型組大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、
Hes 1及NF - kB蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P < 鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF - kB蛋白表
表3大豆肽對哮喘大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF - kB mRNA表達(dá)水平的影響（x 土 s, n = 10)0.001);與哮喘模型組比較，大豆肽600 mg/kg組大 達(dá)水平顯著下調(diào)（P <0.001)。結(jié)果見圖3、表4。
組別 | 濃度（mg/kg) | Notch 1/ p - actin | Jagged 1/ p - actin | Hes 1/ p - actin | NF - kB / p - actin |
正常對照 | - | 0.167?.029 | 0.249 ?.035 | 0.210?.039 | 0.116?.020 |
哮喘模型 | - | 0.458 ?.037b | 0.669 ?.050b | 0.435 ?.060b | 0.805 ?.037b |
大豆肽高劑量 | 600 | 0.317?.042ac | 0.313?.039d | 0.291?.018ac | 0.564 ?.044bd |
F值 |
| 47. 721 | 88.186 | 21.273 | 293.292 |
P值 |
| <0.001 | <0.001 | 0. 002 | <0.001 |
注：與正常對照組比較,P <0.05, bP <0.01;與哮喘模型組比較,P <0.05, dP <0.01
表4大豆肽對哮喘大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、Hes 1及NF- kB蛋白表達(dá)水平的影響（x 土 s, n = 10)
組別 | 濃度（mg/kg) | Notch 1 /p - actin | Jagged 1 /p - actin | Hes 1 /p - actin | NF - kB / p - actin |
正常對照 | - | 0.189 ?.040 | 0. 365 ?0. 043 | 0. 264 ?0. 027 | 0.258 ?.056 |
哮喘模型 | - | 0. 775 ?0. 042b | 0.869 ?.047b | 0.684 ?.046b | 0. 908 ?0. 042b |
大豆肽高劑量 | 600 | 0.552?.032bd | 0.601?.030bd | 0.551?.050bc | 0.736 ?.058bc |
F值 |
| 178. 316 | 115.681 | 78. 753 | 123. 500 |
P值 |
| 0. 000 | 0. 000 | 0. 000 | 0. 000 |
注：與正常對照組比較,P <0.05, bP <0.01;與哮喘模型組比較,P <0.05, dP <0.01
3討論
支氣管哮喘是多種炎性細(xì)胞浸潤或炎癥介質(zhì)參 與的以氣道高反應(yīng)性及重塑為特點(diǎn)，伴有氣管痙攣、 呼吸困難、咳嗽及喘息等癥狀的呼吸系統(tǒng)炎癥性疾 病&]。在本研究中，與正常對照組比較，哮喘模型組 大鼠BALF中中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞 計數(shù)明顯增多，且HE病理切片觀察到氣管壁增厚， 管腔變窄，可見多量散在炎性細(xì)胞浸潤，以上結(jié)果與 哮喘的炎癥變化及病理學(xué)改變相一致，表明OVA致 哮喘大鼠模型成功建立。同時，與哮喘模型組比較,大豆肽600、00 mg/kg可減少哮喘大鼠BALF中中性 粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，且肺組織病理 學(xué)損傷得到明顯改善，提示大豆肽可減輕哮喘大鼠氣 道炎癥，改善肺組織病理性損傷，對哮喘有一定的防 治作用，但大豆肽防治哮喘的具體機(jī)制尚不明確。研 究表明，炎癥是導(dǎo)致哮喘患者或哮喘動物模型氣道增 殖、氣管重塑及肺組織損傷等病理變化的重要因素， 控制炎癥反應(yīng)是緩解哮喘癥狀的重要措施8 ,為此本 研究以 Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF - kB 這_炎癥信 號通路為研究靶點(diǎn)，探討大豆肽抗炎平喘分子機(jī)制。
哮喘的發(fā)生發(fā)展與炎癥細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)（如
IL-lp、IL-6及TNF-a等）激活Notch 1信號通路 密切相關(guān)9 — 10]。Notch 1信號通路由其相應(yīng)的配體 (Jagged 1)、受體（Notch 1)及上下游信號效應(yīng)分子 (Hes 1、NF - kB)等組成，其調(diào)節(jié)異常可介導(dǎo)哮喘炎 癥的發(fā)生，參與氣道增殖、氣管重塑等病理過程[11]。 在炎癥刺激作用下，Jagged 1與Notch 1相互結(jié)合， Notch 1 路即被激活，高表達(dá) Notch
(notch intracellular domain, NICD)被釋放，其下游 Hes 1等關(guān)鍵靶基因被啟動，從而上調(diào)氣道上皮膠原蛋白 的表達(dá)，誘發(fā)氣道上皮下增殖和纖維化，引起哮喘氣 道重塑等病理性損傷[12-13]。NF - kB是Notch 1信號 通路調(diào)控巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)主要靶分子之一， Notch 1通路活化后，激活I - kB激酶（I - kB kinase, IKK), IKK作用于I - kB使其發(fā)生磷酸化，使得NF - kB/ I - kB二聚體復(fù)合物解離,NF - kB發(fā)生磷酸化 并通過核膜轉(zhuǎn)移進(jìn)入核內(nèi)，與DNA特異性結(jié)合位點(diǎn) 相互作用，快速啟動IL - 6、IL - 5及TNF - a等靶基 因的轉(zhuǎn)錄,生成相應(yīng)的炎癥因子，促使炎癥反應(yīng)的發(fā) 生[14]。同時,生成的炎癥因子又是Notch 1和NF - kB 的活化劑，進(jìn)一步激活 Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF -kB信號通路，如此周而復(fù)始使炎癥反應(yīng)持續(xù)放大 和擴(kuò)散，使哮喘癥狀不斷加重，誘發(fā)氣道內(nèi)皮細(xì)胞增 殖和氣管重塑等病理性損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，大豆 肽600 mg/kg可使哮喘大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降， 提示其抗炎平喘機(jī)制與下調(diào)Notch 1/Jagged 1/Hes 1/ NF-kB信號通路有關(guān)。
