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摘要
新物體識別測試(ORT)是一種常用的行為分析方法，也稱作新物體識別測試，用于研究小鼠學(xué)習(xí)和記憶的各個(gè)方面。ORT比較簡單，可以在3天內(nèi)完成:習(xí)慣期、訓(xùn)練期和測試期。在訓(xùn)練期間，小鼠可以探索兩個(gè)相同的物體。在測試期，將一個(gè)訓(xùn)練期的物體替換為一個(gè)新物體。因?yàn)樾∈笥幸环N天生的對新奇事物的偏好，如果小鼠識別了熟悉的物體，它就會(huì)把大部分時(shí)間花在新物體上。由于這種天生的偏好，不需要積極或者消極地強(qiáng)化訓(xùn)練或長時(shí)間培訓(xùn)。此外，ORT還可以被許多應(yīng)用領(lǐng)域應(yīng)用改良。比如記憶間隔可以縮短，用來檢查短期記憶，也可以延長，用來檢查長期記憶。藥理學(xué)干預(yù)可用在訓(xùn)練前、訓(xùn)練后或回憶前的不同時(shí)間段內(nèi)，用來調(diào)查學(xué)習(xí)的不同階段(即習(xí)得、早期或晚期鞏固或回憶)。總的來說，ORT是一種相對壓力低且有效的小鼠記憶測試，適用于檢測藥理學(xué)、生物學(xué)或遺傳操作后的神經(jīng)心理變化。
介紹
物體識別測試(ORT)，，是一種快速有效的測試小鼠不同階段學(xué)習(xí)和記憶的方法。它最初是在1988年由Ennaceur和Delacour提出的，主要用于大鼠; 然而當(dāng)時(shí)它也被成功地用于小鼠測試。這個(gè)測試只需要三個(gè)階段：習(xí)慣期、訓(xùn)練期和測試期。訓(xùn)練期只是對兩個(gè)相同物體的視覺探索，而測試期會(huì)用一個(gè)新物體替換之前已探索的物體之一。因?yàn)閲X動(dòng)物對新奇事物有天生的偏好，嚙齒動(dòng)物記住熟悉物體的情況下，會(huì)花更多的時(shí)間探索新物體。
ORT相對于其他嚙齒類動(dòng)物記憶測試的主要優(yōu)勢：它依賴于嚙齒類動(dòng)物探索新奇事物的自然傾向。因此，不需要大量的培訓(xùn)課程或任何積極或消極的強(qiáng)化來激勵(lì)促進(jìn)。與其他測試相比，ORT的壓力要小得多，而且比Morris水迷宮或Barnes迷宮等常用的記憶測試所需時(shí)間要少， 這兩種測試都需要一周甚至更長時(shí)間。因此，ORT與許多其他嚙齒類動(dòng)物記憶測試相比，ORT測試條件更接近于目前研究已認(rèn)知的條件，增加了該測試的生態(tài)學(xué)正確性。類似地，由于ORT是一種簡單的視覺回憶任務(wù)，它已被成功地用于許多物種，包括人類和非人類靈長類動(dòng)物，用來評估不同物種間的陳述性記憶不同面。最后，ORT可以很容易地進(jìn)行修改，應(yīng)用在檢查學(xué)習(xí)和記憶的不同階段(如獲取、鞏固或回憶)，評估不同類型的記憶(如空間記憶)，或評估不同的保持間隔(如短期記憶vs長期記憶)。
ORT的通用性為無數(shù)的研究應(yīng)用提供了一個(gè)平臺。研究可以利用藥物來干擾或增強(qiáng)記憶。在訓(xùn)練前、訓(xùn)練后或測試前改變給藥時(shí)間，可以暗示導(dǎo)致記憶中斷或增強(qiáng)的潛在神經(jīng)機(jī)制。類似地，光遺傳技術(shù)可以在這些相同的或不同的時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行觀察神經(jīng)激活/抑制，這樣助于學(xué)習(xí)和記憶的不同階段。ORT也適用于評估轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、損傷研究、神經(jīng)退行性模型或衰老研究中的差異。訓(xùn)練和測試之間的時(shí)間被稱為記憶保持間隔，可以通過記憶保持間隔的變化來評估短期和長期記憶的變化。最后，ORT可以作為研究學(xué)習(xí)和記憶的藥理學(xué)、遺傳學(xué)和神經(jīng)學(xué)變化的工具，或者這些工具用作研究ORT學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)操作
一. 物體選擇和實(shí)驗(yàn)設(shè)置
1. 選擇不同的物體(需要很容易被小鼠識別)，但也要有相似的復(fù)雜性(紋理，形狀，顏色圖案和正確性等)，最小化任何潛在的可能因素，否則導(dǎo)致結(jié)果偏差。
1.1 測試天生偏好和辨別能力(見步驟2和3)。
1.2 使用和小鼠差不多大的物體或略大的物體，減少誘導(dǎo)偏好，促進(jìn)探索(圖1)， 確保小鼠能夠爬上兩個(gè)物體或兩個(gè)都爬不上(只能爬上一個(gè)物體可能會(huì)增加探索的興趣，且爬在一個(gè)物體的時(shí)間不計(jì)入探索時(shí)間)。
1.3 每個(gè)物體至少有兩個(gè)備品。為了盡量減少測試過程中潛在的氣味線索，每個(gè)物體至少有3個(gè)備品，一個(gè)用于訓(xùn)練，一個(gè)用于測試。
1.4 使用不易碎材料制成的物品，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)過程中物體損壞而丟失的物品可能會(huì)干擾試驗(yàn)的連續(xù)性，并可能對動(dòng)物造成傷害。
1.5 在使用前和使用時(shí)*清潔物品(以70%的乙醇為宜)
2. 為了減少明亮照明的影響，使用擴(kuò)散的低照明設(shè)備，迷宮的中心照明約20lux。使用溫度和濕度相同的房間條件，如果小鼠被從一個(gè)房間轉(zhuǎn)移到另一個(gè)房間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每天使用前至少要讓小鼠適應(yīng)新房間1小時(shí)。
3. 在訓(xùn)練前做好對小鼠的撫摸。因?yàn)檫@個(gè)測試依賴于嚙齒類動(dòng)物探索新奇事物的自然傾向，所以要減少任何壓力或焦慮，否則這些壓力或焦慮可能會(huì)干擾它們的探索，以及隨后探索物體的yu望。理想情況下，在試驗(yàn)前1~2周，每天撫摸小鼠1~2次，每次至少1分鐘。
4. 測試箱使用一個(gè)正方形的箱體(約40厘米× 40厘米× 40厘米，也可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)修改)，由白色或黑色的無孔塑料制成，與小鼠的顏色形成對比。或使用一個(gè)圓形的測試箱，因?yàn)橄噍^于方形測試箱，圓形測試箱可能更適合促進(jìn)探索行為——焦慮的小鼠可能會(huì)趴在一個(gè)方形測試箱的角落里，圓形測試箱可能更適合促進(jìn)探索行為.
4.1 在訓(xùn)練期時(shí)，將兩個(gè)相同的物體放在對角線上(即一個(gè)在西北角，一個(gè)在東南角)。如果物體太輕，小鼠能夠移動(dòng)物體，可以把物體固定在底板上，可拆卸安裝的膠體將之粘貼在底座上的效果就很好。
4.2 在測試期時(shí)，使用每個(gè)物體的第三個(gè)備品，將一個(gè)熟悉的物體和一個(gè)新物體放在與訓(xùn)練時(shí)相同的對角線上(圖2)。
4.3 平衡每組物體的分配使用，熟悉物體和新物體同時(shí)換組使用。在物體在測試箱的四個(gè)角落的位置要相同，并且一定要注意哪條對角線用于哪只動(dòng)物，以便每只小鼠在訓(xùn)練時(shí)使用的對角線與在測試時(shí)使用的對角線相同。
4.4 在使用前和使用時(shí)*清潔設(shè)備和物體以去除氣味(以70%的乙醇為宜)
5. 將相機(jī)安裝在測試箱上方，以獲得最佳的探索視角。為了準(zhǔn)確分析，只使用帶有鼻尖檢測的軟件。使用軟件在開始拍攝前，先拍攝背景圖像，并將物體放置到位。在軟件中，將探測區(qū)域設(shè)置為物體周圍約2~3厘米。
6. 實(shí)驗(yàn)需要記錄下這個(gè)試驗(yàn)，然后給它打分。為了減少實(shí)驗(yàn)者的干擾，要讓實(shí)驗(yàn)者在小鼠看不見的地方。如果在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行手動(dòng)評分，請確保實(shí)驗(yàn)者距離測試箱1米以上，并且小鼠無法看到實(shí)驗(yàn)員。
注意:任何時(shí)候小鼠停留在物體上而不主動(dòng)進(jìn)行觸須掃瞄或嗅探都不能算作探索時(shí)間。
7. 將探索定義為當(dāng)小鼠的鼻尖指向目標(biāo)物體，并且在距離目標(biāo)2~3厘米的范圍內(nèi)，用主動(dòng)的觸須掃瞄或嗅探。不計(jì)算任何沒有積極探索性質(zhì)的爬在物體上的時(shí)間。
二. 必要的試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)
1.1 為了小鼠能夠適應(yīng)，把小鼠從籠子里拿出來，并把它放在曠場(測試箱)的中間。允許小鼠自由探索5分鐘。
1.2 在訓(xùn)練期內(nèi)，在測試箱的對角線放置2個(gè)不同的物體(即西北和東南角)。把小鼠從它的籠子里拿出來，放在曠場(測試箱)的中央。允許自由探索10分鐘。
1.3 計(jì)算識別指數(shù)。如果沒有誘導(dǎo)偏好，則識別指數(shù)應(yīng)在零或接近零。任何顯示優(yōu)先級的物體都不要應(yīng)用于ORT。
2. 識別能力測驗(yàn)
2.1. 為了小鼠能夠適應(yīng)，把小鼠從籠子里拿出來，并把它放在曠場(測試箱)的中間。允許小鼠自由探索5分鐘。
2.2 在訓(xùn)練階段(T1)中，將2個(gè)相同的物體放在對角線位置。將小鼠放在測試箱中心，允許小鼠探索10分鐘。
2.3 在測試階段(T2)，將T1期間熟悉的物體備品和一個(gè)新物體放在對角線位置(即西北角和東南角)。
T1后60分鐘，將小鼠放在測試箱中心，允許自由探索10分鐘。
2.4 計(jì)算識別指數(shù)， 在保持間隔60分鐘時(shí)，鑒別指數(shù)應(yīng)高于0.25。
三. 實(shí)驗(yàn)的程序
1.1 把小鼠從它的籠子里拿出來，放在曠場(測試箱)的中間。允許小鼠自由探索5分鐘。籠子如果使用過一遍，就把它留作第二天用的籠子。
1.2 5分鐘后，取出小鼠并放入籠中。不要將小鼠放回原來的籠子，否則可能影響其余待測試小鼠的行為。
1.3用70%的乙醇*清潔小鼠的設(shè)備。
注意:在習(xí)慣化期間，可以通過計(jì)算小鼠在曠場中心花費(fèi)的時(shí)間來評估類似焦慮的行為
T1的時(shí)間長度時(shí)是一個(gè)有用的度量，高焦慮的小鼠可能需要10分鐘的時(shí)間來達(dá)到最di勘探準(zhǔn)則。
2. 訓(xùn)練期(T1)
2.1 將兩個(gè)相同的物體放置在測試箱對角線的位置(即東北角和西南角)。
2.2 習(xí)慣化24小時(shí)后，將小鼠從鼠籠中取出，置于測試箱中心，與兩個(gè)相同的物體保持等距離。
2.3 允許自由探索至少5分鐘。如果使用一只低活動(dòng)量或探索量的小鼠(如大多數(shù)小鼠沒有在5分鐘內(nèi)探索兩個(gè)物體各20s， 同樣適用于試點(diǎn)實(shí)驗(yàn))， 那么就擴(kuò)展隊(duì)列中所有小鼠的試驗(yàn)到10分鐘。
2.4 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將小鼠移出并放入籠中。籠子如果使用過一遍，就把它留作測試時(shí)的籠舍。
2.5 用70%乙醇*清潔小鼠的設(shè)備和物體。
3.測試期(T2)
3.1 將T1期間使用的一個(gè)物體(熟悉的物體)和一個(gè)新物體放在測試箱對角線的位置。對每個(gè)小鼠都使用它們在T1期間相同的物體位置。
3.2 在T1到T2的選擇間隔時(shí)間內(nèi)，將小鼠從籠子中取出，并將它放在測試箱中心，保持和兩個(gè)物體的距離等距。
注:在24小時(shí)的保留間隔中，大多數(shù)小鼠將無法區(qū)分熟悉的和新的物體(通常-0.2 < d2 < 0作為可信的控制度)，如果測試益智作用，使用這個(gè)時(shí)間點(diǎn)來探測記憶增強(qiáng)。為了檢測記憶缺陷，根據(jù)小鼠的不同，使用20分鐘到4小時(shí)的較短的記憶間隔。
3.3 允許自由探索10分鐘。試驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠移出并放入籠中。
3.4 T1和T2都在前面5分鐘評分。如果小鼠沒有達(dá)到對兩個(gè)物體的最小20秒的探索時(shí)間，超過5分鐘繼續(xù)評分，直到總探索時(shí)間超過20秒。
四. 數(shù)據(jù)分析
1. 排除標(biāo)準(zhǔn)
1.1 在訓(xùn)練(T1)和測試(T2)期間，計(jì)算每個(gè)期間(e1和e2)中兩個(gè)的物體總探索時(shí)間。大多數(shù)小鼠兩個(gè)目標(biāo)的最小探索時(shí)間應(yīng)該是在5分鐘內(nèi)達(dá)到20秒
1.2 對于探索程度低且不滿足最di標(biāo)準(zhǔn)的品系，將T1和T2時(shí)間延長至10 min，可以在試點(diǎn)測試期間觀察到。
1.3 評分達(dá)到5分鐘或5分鐘以上，直到達(dá)到20秒的最di標(biāo)準(zhǔn)。
1.4. 如果小鼠在T1或T2時(shí)間10分鐘內(nèi)對兩個(gè)物體的探索都沒有達(dá)到20秒的最di時(shí)間，則排除在分析之外，因?yàn)闊o法確定它們是否花了足夠的時(shí)間來學(xué)習(xí)/辨別。
2. 絕對分析與相對分析
注:不同的分析公式及其相互關(guān)系見表1。
2.1 計(jì)算e1為2個(gè)相同物體訓(xùn)練時(shí)的總探索時(shí)間，其中a1和a2為相同物體。
E1 = a1 + a2
2.2 計(jì)算e2為測試熟悉物體(a)和新物體(b)的總探索時(shí)間。
e2 = a + b
2.3 d1簡單地計(jì)算為探索新物體所花費(fèi)的時(shí)間減去探索熟悉物體所花費(fèi)的時(shí)間。絕對鑒別測量(d1)沒有考慮小鼠或治療組之間探索時(shí)間的差異，盡管在某些情況下，它可能是一個(gè)更敏感的測量2。
d1 = b
2.4 d2是探索新物體所花費(fèi)的時(shí)間減去探索熟悉物體所花費(fèi)的時(shí)間除以總探索時(shí)間。zui常用的測量方法是相對判別值，通常稱為判別指數(shù)(d2)，不受探測時(shí)間差異的影響。所有的值都在-1和+1之間。
d2 = d1 / e2
2.5 或者，計(jì)算識別或偏好指數(shù)(d3)。這是花在探索新事物上的時(shí)間除以總時(shí)間。所有的值都在0和1之間，通常乘以100，用作百分比值。
d3 = b / e2 * 100
3. 統(tǒng)計(jì)分析
1. 使用每組的平均判別值進(jìn)行單向方差分析，確定記憶性能。為了進(jìn)一步分析，事后對治療組與載體組以及陽性/陰性對照組進(jìn)行雙向比較。
代表性成果
圖2顯示了ORT的一般實(shí)驗(yàn)設(shè)置。在習(xí)慣期(T0)小鼠被放置在曠場環(huán)境5分鐘。24小時(shí)后，小鼠被放置在兩個(gè)相同的物體的測試箱內(nèi)，允許自由探索長達(dá)10分鐘(T1)。在測試期(T2)，小鼠再次被放置在測試箱，但有一個(gè)熟悉的物體和一個(gè)新的物體，并允許探索長達(dá)10分鐘。T1和T2之間的停留時(shí)間間隔，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的最終目標(biāo)而改變。在有代表性的數(shù)據(jù)中，因?yàn)橐种苿┯型鰪?qiáng)記憶的影響，所以經(jīng)藥物處理的小鼠在T1后24小時(shí)內(nèi)被測試應(yīng)該沒有區(qū)別。
磷酸二酯酶2(Phosphodiesterase 2)抑制劑已被證明可以增強(qiáng)ORT中的學(xué)習(xí)和記憶。與之相比，PDE2抑制劑Bay 60-7550或ND7001在訓(xùn)練前30分鐘給予以劑量依賴性的方式顯著記憶增強(qiáng)(圖3a和3b)。在訓(xùn)練和測試的不同時(shí)間點(diǎn)給藥時(shí)，在訓(xùn)練前30分鐘、訓(xùn)練后立即和回憶前30分鐘給予給予 PDE2 抑制劑 Bay 60-7550 記憶明顯增強(qiáng)（圖 4a 和 4b）。這表明PDE2抑制增強(qiáng)了習(xí)得或早期鞏固機(jī)制以及回憶過程中的記憶。(本實(shí)驗(yàn)選用6 ~ 8周齡的實(shí)驗(yàn)未成熟雄性ICR小鼠。)
在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，必須考慮許多因素。小鼠的品種對探索時(shí)間和積極物體識別的保留時(shí)間都有很大的影響。S?k及其同事分析了一些常用的品系，包括C57BL、Swiss、BALB/c和129/Sv小鼠。結(jié)果表明，各品系總探查時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異，其中Swiss和Balb/c的探查時(shí)間最長，C57BL和129/sv的探查時(shí)間最短。這會(huì)影響絕對區(qū)分值(d1)。此外，隨著時(shí)間的推移，保留時(shí)間顯著減少，129/Sv小鼠在1 h時(shí)d2值最di(圖5)。對于129/Sv品系，這可能是由于它們的探索水平較低，不一定是缺乏識別。值得注意的是，在本研究中，研究人員使用了較短的T1和T2(每次試驗(yàn)3 min)，這導(dǎo)致4個(gè)品系中只有2個(gè)品系達(dá)到了本文建議的最小20 s的探索時(shí)間。通常這個(gè)最小標(biāo)準(zhǔn)被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和探索對象所需的最小時(shí)間。這里引用的研究，證明了擁有這樣一個(gè)最di標(biāo)準(zhǔn)的重要性。
圖1:在ORT中使用的樣本物體。Lueptow等人使用的物體很簡單，但有幾個(gè)明顯的特征。所有的物體都比普通小鼠稍大一點(diǎn)，可以很容易地爬上去。從左到右依次是一個(gè)倒置的酒杯，一個(gè)帶膠帶的玩具積木，一個(gè)冰袋，一個(gè)有突出的眼睛的玩具積木。可拆卸膠體的將物體粘在底板上，以免在探索過程中移動(dòng)或傾倒。
圖2:ORT的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，ORT實(shí)驗(yàn)通常持續(xù)3天以上。第一天是習(xí)慣化(T0)，允許小鼠在開曠箱中探索5分鐘。第2天是訓(xùn)練(T1)，小鼠沿著對角線放置2個(gè)相同的物體去探索測試箱。測試(T2)在T1后24小時(shí)進(jìn)行(根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，間隔時(shí)間可以縮短或延長)。小鼠沿著對角線放置一個(gè)熟悉的物體和一個(gè)新奇的物體來探索測試箱。
圖3:ORT劑量依賴性記憶增強(qiáng)。(a) Bay 607550和(b) ND7001，當(dāng)訓(xùn)練前30分鐘給予時(shí)，以劑量依賴的方式改善記憶，從識別指數(shù)(d2)的增加可以看出。條形代表平均值±S.E.M.; N = 每組10-18。相較于載體小鼠p = 0.05， *p <0.05， **p <0.01， ***p <0.001.
圖4:習(xí)得、早期鞏固或回憶過程中的PDE2抑制劑顯著增強(qiáng)ORT中的記憶。(a) 607550 Bay (3 mg/kg)在訓(xùn)練(習(xí)得)前30分鐘給予，顯著增強(qiáng)記憶。(b)在訓(xùn)練(鞏固)后立即或測試(回憶)前30分鐘給予607550 Bay (3 mg/kg)顯著增強(qiáng)記憶，從識別指數(shù)(d2)的增加可以看出。條形代表平均值±S.E.M. N = 每組10-18。相較于載體小鼠p = 0.05， *p <0.05， **p <0.01， ***p <0.001.
圖5:品種不同的小鼠保持不同的時(shí)間間隔，C57BL、Swiss、BALB/c和129/Sv小鼠在不同時(shí)間間隔條件下的物體識別任務(wù)中相對識別指數(shù)d2的表現(xiàn)。所有的品種在間隔1小時(shí)時(shí)區(qū)分不同的物體，但在間隔4小時(shí)和24小時(shí)時(shí)不區(qū)分。值代表平均值(±S.E.M.)。虛線之間的區(qū)域表示虛組的s.e.m.范圍(均值:0，s.e.m.: 0.06)。
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